Optimización en el diagnóstico de RHDV2
El virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV) es un calicivirus altamente contagioso y que causa una elevada mortalidad tanto en conejos domésticos como salvajes. Se caracteriza por una hepatitis vírica aguda, aunque se pueden encontrar hemorragias en otros órganos debido a una coagulación intravascular diseminada.
Se han descrito dos tipos de RHDV en base a diferencias filogenéticas y antigénicas: RHDV1 (clásico) y RHDV2 (variante o RHDVb). Estudios epidemiológicos demuestran que el RHDV2 ha desplazado, en la gran mayoría de casos, al RHDV1.
Datos obtenidos en DIAGNOS (Laboratorios HIPRA) a partir de casos clínicos en España corroboran este desplazamiento, ya que entre 2018 y 2021 todas las cepas detectadas han sido del tipo RHDV2.
En caso de un brote de RHDV las intervenciones veterinarias han de ser inmediatas.
Éstas incluyen la vacunación de emergencia de todos los animales, la cual ha demostrado ser eficaz frente a un brote, el aislamiento de los lotes afectados y el establecimiento de medidas excepcionales de contención, además de las necropsias y toma de muestras. Por estos motivos, el tiempo de respuesta del laboratorio en cuanto a la confirmación del agente etiológico debe ser el mínimo posible.
El diagnóstico de la RHD se puede realizar mediante la detección rápida de antígeno en granja o por RT-qPCR en el laboratorio.
Los kits de antígeno, aunque útiles como método rápido de point-of-care, han mostrado menor sensibilidad que la RT-qPCR. Ésta, por su parte, muestra mayor sensibilidad.
Sin embargo, tanto la manipulación de las muestras infecciosas como el tiempo y las condiciones de transporte (en refrigeración) hasta el laboratorio pueden limitar su detectabilidad.
Por dichas razones se decidió adaptar y validar un protocolo alternativo de conservación, transporte y análisis de muestras para el diagnóstico de RHD basado en tarjetas FTA, las cuales fijan e inactivan el virus para su posterior análisis por RT-qPCR. La muestra que se decidió validar es la de hígado, ya que es la que contiene mayor cantidad de RHD.
La Tarjeta FTA
Cuando la muestra entra en contacto con ella, rehidrata los reactivos y estos actúan lisando las membranas celulares y los orgánulos de los microorganismos presentes, incluyendo a los patógenos.
Los ácidos nucleicos son liberados e inmovilizados en el papel de manera estable, protegidos de la degradación por periodos largos de tiempo en condiciones de temperatura ambiente, baja humedad y protegidos de la luz ultravioleta.
Protocolo de muestreo
Para una correcta toma de muestra es necesaria una zona limpia y utilizar material estéril para evitar posibles contaminaciones.
Para transferir la muestra a la tarjeta FTA, es importante colocar la cara interna del hígado sobre uno de los círculos y ejercer presión sin frotar, para evitar roturas en el papel.
Para optimizar el diagnóstico, cada círculo permite transferir 2 muestras procedentes de diferentes animales. Posteriormente, deberemos dejar secar la tarjeta FTA durante unas 3 horas a temperatura ambiente.
Una vez secada, ya podemos enviarla al laboratorio a temperatura ambiente, sin necesidad de que vaya ni refrigerada ni congelada.
Inoculación de una muestra clínica en una tarjeta FTA.
Validación del método
La primera fase de la validación consistió en verificar que el ARN del RHDV2 se fijaba y se mantenía estable en la tarjeta FTA. Para ello se utilizó una muestra de referencia que fue analizada por RT-qPCR por ambos métodos, el tradicional y el de FTA.
Los resultados mostraron que la FTA permitió que el RHDV2 se mantuviera estable hasta 8 semanas después de su inoculación (Tabla 1).
La segunda fase de la validación consistió en comparar los parámetros diagnósticos por ambos métodos. Para ello se analizaron por RT-qPCR 29 muestras clínicas de casos sospechosos de RHD en España.
Los resultados mostraron un 100% de concordancia entre ambos métodos al discriminar las muestras en positivas y negativas; detectando 26 muestras positivas (89,7%) y 3 negativas (10,3%).
Los resultados obtenidos demuestran una buena optimización de la metodología FTA para la RT-qPCR de RHDV2. Este resultado abre las puertas a un muestreo con mayor facilidad, y la confirmación ágil de la RHD.
La sencillez y asepsia que proporciona la toma de muestras de hígado en las tarjetas FTA, su envío a temperatura ambiente, la inactivación de los patógenos y la estabilidad del ARN del RHDV2 mejoran notablemente el diagnóstico actual basado en muestras frescas.